冬虫夏草对焦虑小鼠行为干预的研究

摘要:目的探讨冬虫夏草对广泛性焦虑小鼠行为干预的影响。方法雄性昆明种小鼠40只随机均分成4组:生理盐水组、地西泮组、低剂量虫草组、高剂量虫草组,每组各10只小鼠。地西泮组前3 d灌胃生理盐水,后4 d灌胃地西泮。低、高剂量虫草组分别连续灌胃7 d不同剂量的冬虫夏草口服液。生理盐水组连续灌胃7 d等容积的生理盐水(1 mL)。所有实验组小鼠7 d后开始进行联合开场、明暗箱行为检测。结果联合开场实验中各药物组与生理盐水组比较,地西泮组与高剂量虫草组在中央区活动时间、距离和穿梭时间上均有显著性差异(P 0.05或P 0.01),而低剂量虫草组无显著性差异(P 0.05)。明暗箱实验中各药物组与生理盐水组比较,地西泮组与高剂量虫草组在明箱活动时间、相对活动时间、明箱活动路程和穿梭次数上均有显著性差异(P 0.01),而低剂量虫草组无显著性差异(P 0.05)。结论小鼠焦虑行为检测结果提示,0.75 g/(kg d)生药含量的低剂量虫草无抗焦虑效果,而7.5 g/(kg d)生药含量的高剂量虫草抗焦虑效果明显。

冬虫夏草,学名CordycepsSinensis(Berk)Saccardo,直译为 中国棒头菌 ,为麦角菌科冬虫夏草菌与其寄生主蝙蝠蛾、虫草蝙蝠蛾或绿蝙蝠蛾幼虫的尸体复合物,中国冬虫夏草最早的文字记载见于清朝汪昂的《本草备要》。虽然世界上虫草种类繁多,但冬虫夏草仅为中国特产,且以青藏高原海拔3 500~5 000 m高寒山脉所产质量最佳。

我国传统医学宝典《本草备要》、《本草从新》和《本草纲目拾遗》中多处指出:冬虫夏草属 味甘、性温 , 入肺肾二经 ,有明显滋肺阴、补肾阳作用,是一种阴阳双补的药物。以往的研究表明冬虫夏草对于提高免疫系统、生殖系统能力,对抗肿瘤、治疗肺病、肝病、肾病和消除放化疗副作用有较好的远期疗效。但对于冬虫夏草抗焦虑药效和机制的研究报道较少,而目前国内抗焦虑中药市场紧缺,患者需求大,因此本研究利用海军医学研究所研制的冬虫夏草口服液,对焦虑小鼠行为的干预作用开展研究,以期开发传统中药的新疗效。

1 材料与方法

1.1 药物提取冬虫夏草口服液由海军医学研究所试制工厂提供,虫草生药含量为0.1 g/(10 mL 支)。口服液采用产自青海的野生冬虫夏草为原料,结合现代生物提取技术研制,南京军区非标准制剂批号为南制字(2006)F59001号。以上虫草口服液利用自制的负压浓缩装置反复蒸馏浓缩处理后的浓缩液中虫草生药质量浓度为1 g/mL。

1.2 动物与分组昆明种小鼠40只,雄性,体质量(20±2)g,购于第二军医大学实验动物中心。小鼠适应性饲养1周后,随机均分成4组:生理盐水组、地西泮组、低剂量虫草组、高剂量虫草组,每组各10只小鼠。地西泮组前3 d灌胃生理盐水,后4 d灌胃5 mg/(kg d)地西泮;低剂量虫草组连续灌胃7 d生药含量0.75 g/(kg d)的冬虫夏草;高剂量虫草组连续灌胃7 d生药含量7.5 (kg d)的冬虫夏草。生理盐水组连续灌胃7 d等容积的生理盐水(1 mL)。所有动物按组别分笼喂养,自由进食饮水,7 d后开始进行小鼠联合开场与明暗箱行为检测。

1.3 仪器与分析联合开场行为实验视频分析系统(Com-bined Open Field Test Analysis System)、明暗箱视频分析系统(Light-dark Test Analysis System),均为上海吉量软件科技有限公司生产,其配套软件可以实时记录小鼠各项行为指标,以及运动轨迹图和实时监控录像,以Excel数据库形式保存。实验数据均使用Excel软件的数据分析库进行单因素方差统计分析,组间差异使用LSD-t方法进行多个样本均数间的两两比较。

1.4 行为检测小鼠连续灌胃7 d,末次给药30 min后,分别进行联合开场和明暗箱行为检测。联合开场实验时,将小鼠放入箱底正中区,同时开始计时,箱内安置有红外线发射器和摄像装置,可以同时有效记录小鼠的各种活动行为,每只小鼠连续进行6 min记录。明暗箱行为检测时,将小鼠置于暗箱中央,面朝明箱,记录小鼠20 rain内在明箱和暗箱中的各种活动行为。行为检测操作时应保持外界环境安静,每次放入小鼠前清理干净箱内的排泄物,尽可能保证每批次检测的客观性。

2 结果

2.1 对小鼠联合开场实验各指标的影响本实验设计采用的联合开场行为指标包括:中央区活动时间、中央区活动路程、穿梭时间。表1提示各药物组与生理盐水组中央区活动时间比较:地西泮组、高剂量虫草组有显著性差异(P 0.05),而低剂量虫草组无显著性差异(P 0.05)。各药物组与生理盐水组中央区活动距离比较:地西泮组、高剂量虫草组有明显显著性差异(P 0.01),而低剂量虫草组无显著性差异(P 0.05)。各药物组与生理盐水组穿梭时间比较:地西泮组有明显显著性差异(P 0.O1)、高剂量虫草组有显著性差异(P 0.05),低剂量组虫草组无显著性差异(P 0.05)。

2.2 对小鼠明暗箱实验各指标的影响本实验设计采用的明暗箱行为指标包括:明箱活动时间、相对活动时间(明箱活动时间/(明箱+暗箱活动时间))、明箱活动路程、穿梭次数。表2结果提示各药物组与生理盐水组明箱活动时间、相对活动时间、明箱活动距离和穿梭次数比较:地西泮组、高剂量虫草组均有明显显著性差异(P 0.01),而低剂量虫草组无显著性差异(P 0.05)。

3 讨论

临床上焦虑症包括广泛性焦虑(GAD)及发作性惊恐(PD)两种状态,该类患者主要表现为过分焦虑、恐惧、行为逃避、易觉醒等一系列症状。实际上焦虑与恐惧是紧密相联的,恐惧与具体的刺激有关,而焦虑则是更加广泛化的一个概念。利用不同环境刺激小鼠建立焦虑模型的理论基础是:小鼠天生喜暗恶光又爱好探索,当小鼠进入联合开场箱或明暗箱等陌生环境中,面对新刺激会同时产生探索的冲动与对潜在危险的恐惧,前者行为表现在其对中央区域、洞眼和明箱等新奇环境的探索行为,而后者行为表现在其固守周边区域和暗箱的保守行为,挑战一趋避这对矛盾冲突在动物身上复现了诱导人类焦虑产生的行为冲突模式。小鼠在联合开场实验训和明暗箱行为实验圳中,在中央区、明箱活动时间越长,探洞、穿梭次数和时间越长,反映小鼠对新环境的探索欲望水平越高,探索欲越强则代表环境适应能力越强,焦虑水平越低。

据前人文献报道,虫草制剂对神经系统有一定镇静作用,注射后能增加阈下量戊巴比妥的入睡率,增强氯丙嗪等镇静剂的效果,拮抗苯丙胺、咖啡因等的兴奋作用,但对小鼠焦虑行为干预的药效学研究并无相关报道。本研究通过联合开场、明暗箱行为实验,可以初步认为0.75g/(kg :d)低剂量的虫草口服液无明显抗焦虑效果,而7.5g(kg d)高剂量组的虫草口服液抗焦虑效果较为明显。考虑动物行为检测的个体差异可能比较大,所以本实验选取了较为经典的2种焦虑行为检测方法,实验结果相互印证,提示冬虫夏草对抗广泛性焦虑有一定作用。此外,赵光等曾经报道小鼠服用不同剂量虫草片28 d后爬杆运动能力增强,血尿素氮含量降低,脑内r-氨基丁(GABA)含量升高,提示其具有抗体力性疲劳的作用。我们分析:GABA是影响焦虑产生的主要抑制性神经递质,地西泮等苯二氮卓类药物正是通过调节GABA能神经元的释放发挥其抗焦虑的作用,因此冬虫夏草也很可能是通过调节GABA水平来发挥其抗焦虑的药效,具体作用机制还有待进一步研究探讨。